快收藏！如何鉴别非瘟弱毒株和强野毒株的三重荧光PCR方法方法？

非洲猪瘟 是一种由 非洲猪瘟病毒 引起的高传染性、高死亡率急性猪疫病，控制不及时死亡率可达100%受2018年非洲猪瘟的影响，我国养猪市场迅速紧缩，部分小规模的养殖场损失惨重，直接以破产的方式终结。研究非洲猪瘟的诊断对于控制非洲猪瘟疫情有着重要的意义，本篇文章 猪好多 将带领大家了解当前各种非瘟诊断技术的关键信息并带着大家了解如何鉴别非瘟弱毒株和强野毒株的三重荧光PCR方法方法。

一、临床诊断

临床诊断凭借不同类型非洲猪瘟的临床特征判断，可作为初诊的依据。根据猪的临床表现进行分类治疗，并对病死猪进行解剖。解剖后如果临床症状与非洲猪瘟一致，则可确诊为非洲猪瘟。

临床表现：

最急性;无明显临床症状突然死亡。

急性;体温可高达42℃,沉郁,厌食,耳,四肢、腹部皮肤有出血点,可视黏膜潮红、发绀。眼,鼻有黏液脓性分泌物;呕吐;便秘,粪便表面有血液和黏液覆盖;或腹泻,粪便带血。共济失调或步态僵直，呼吸困难,病程延长则出现瘫痪、抽搐等其他神经症状。妊娠母猪流产。病死率可达100%。病程4d~10d。

亚急性:临床症状与急性相同,但病情较轻,病死率较低。体温波动无规律,一般高于40.5℃。仔 猪病 死率较高。病程5d~30d。

慢性:波状热,呼吸因难,湿咳。消瘦或发育迟缓,体弱,毛色暗淡。关节肿胀,皮肤溃疡,跛足。死亡率低。病程2个月到15个月。

病理变化：

典型的病理变化实质器官有出血点、肺脏和淋巴结肿大，气管内有血性泡沫样黏液;脾脏肿大，一般情况下是正常脾的3~6倍，易碎，呈暗红色至黑色，边缘钝圆，有时出现边缘梗死;全身血凝不良。最急性型肉眼剖检病变无变化。       

二、实验室诊断

由于ASF的临床症状和病理变化与高致病性蓝耳病、猪瘟、猪丹毒、败血性沙门氏菌病等猪的出血性传染病很相似,所以很难根据临床症状和眼观病变来确诊该病，实验室检测是准确诊断该病所必需的。实验室主要包括病原学和血清学检测方法。

下图是ASF实验室诊断技术一览表：   

最常用的PCR法来诊断非瘟：

1.普通PCR法：

引物针对ASFV B646L基因的保守区域设计。上游引物PPA-1:5'-AGTTATGGGAAAC-CCGACCC-3';下游引物 PPA-2;5'-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3'。扩增产物大小为257bp。

95 ℃预变性10 min;95℃变性15 s,62℃退火 30 s.72℃延伸30 s,40个循环;72℃终延伸7 min。

2.荧光PRC法：

引物和探针针对ASFV B646L基因的保守序列设计。上游引物VP72-F1:5'-GCTTTCAGGAT-AGAGATACAGCTCT-3';下游引物 VP72-R1:5'-CCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAG-3' ;TaqMan探针 VP72-T1;FAM-CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-BHQ1。

50 ℃孵育2min;95 ℃预变性5 min;95 ℃变性15 s.58 ℃退火延伸1 min,45个循环,在每一循环的58℃时收集 FAM荧光信号。    

三、非瘟疫苗毒鉴别诊断

3.三重荧光PCR方法[1]：

3.1此方法的特点是什么：

该法特异性强，可同时检测ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因，与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪A型塞内卡病毒等无交叉反应，且灵敏度高，重复性好，最重要的是可以本方法能鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株（缺失MGF360-505R和/或CD2v基因）。

3.2 鉴别野毒株和基因缺失疫苗株的意义？

现有大多数PCR检测方法都是根据ASFV B646L基因的保守区域设计的，无法区分ASFV野毒感染还是接种了基因缺失疫苗。

疫苗是预防和控制传染病的有效手段。近年来，研制基因缺失减毒活疫苗，特别是多基因家族（Multigene family,MGF)360-505R和CD2v基因缺失毒株已成为ASF疫苗研究重要的方向。ASF基因缺失疫苗一旦研发成功必将得到广泛的应用，因此准确鉴别猪是感染ASFV野毒株还是接种基因缺失疫苗株，对于用疫苗预防和控制ASF至关重要。

3.3 引物和探针的设计:

通过试验筛选出3套用于鉴别检测ASF基因缺失疫苗的引物及探针组合

3.4 ASFV三重荧光PCR的反应体系及反应条件：

通过引物和探针搭配浓度的筛选，25μL反应体系中，实时荧光定量PCR预混液12.5μL,6条引物各0.5μL（终浓度200 nmol/L）、3条探针各0.3μL（终浓度120 nmol/L）、去离子水3.6μL、模板5μL。荧光PCR反应条件为95℃预变性40 s;95℃8 s,58℃45 s（收集FAM、Cy5、VIC三种荧光信号），40个循环。在试验成立的条件下，一种或几种荧光信号有S形扩增曲线且Ct值≤35，判探针相对应的基因阳性；Ct值>40且无S形扩增曲线，判为阴性；35<Ct值≤40判为可疑，需重新检测，若重复检测结果仍为可疑则判为阳性。Ct值≤40判为可疑，需重新检测，若重复检测结果仍为可疑则判为阳性。

3.5 三重荧光PCR诊断结果判定：

本研究根据非洲猪瘟（ASF)B646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了3套引物和探针，3条探针的5'端分别修饰不同的荧光基团以便于同时进行检测和区分3个基因。如果同时检测到3个基因，则表明存在ASFV野毒株核酸；如果检测到B646L基因，但是未检测到MGF360-14L基因和/或CD2v基因时，表明缺少相应的基因，为基因缺失疫苗株。

结语：

1、对传染病病原进行及时有效的诊断是目前控制传染病流行的核心手段。

2、病原体的不断进化，交叉误诊会极大地影响养殖体系健康，需要不断改进检测技术检测方法，不断提高敏感性，特异性，创新使用新方法。

3、家财万贯，防病有效才算！有效防控离不开准确诊断！

（作者：雷猪侠 审改：五山猪侠）